Análisis de sondas y técnicas de amplificación de genes para el diagnóstico y control del tratamiento en la lepra infantil / No disponible

Se detectaron secuencias de ácidos nucleídos de Mycobacterium leprae utilizando sonda de genes que hibridan con secuencias diana RNA ribosómicas (16SrRNA), DNA ribosómico (16S rDNA) y técnicas de amplificación de genes (PCR) en lesiones cutáneas de pacientes de lepra infantil y el efecto del tratamiento farmacológico sobre estas técnicas. Se incluyeron en este trabajo 80 pacientes de lepra infantil. La mayoría de caso (79%) tenía entre 9-16 años. Se dividieron los caso en 3 grupos de acuerdo con el tratamiento, sin tratar (30) en tratamiento (39) y al finalizar el tratamiento (20). Se efectuaron exámenes clínicos y baciloscopia para la detección de bacilos ácido-alcohol resistente BAAR y de las biopsias se extrajeron y fraccionaron los ácidos nucleídos. Se detectó rRNA y rDNA 16S específico de M.leprae mediante hibridación con sondas, mientras que la secuencia del gen 36 kDa se detectó mediante técnicas de amplificación de genes (PCR). Los casos se clasificaron en lepra paucibacilar (PB) y multibacilar (MB) de acuerdo a los criterios de la OMS (1988). La positividad del rRNA 16S en los casos PB disminuyó desde 60% en los casos no tratados al 10,5% después de 4-8 meses de tratamietno, mientras el rDNA 16S disminuyó del 50% al 21% y con PCR desde 70% al 36.8% para la misma muestra y todos se negativizaron al año. La misma tendencia se observó en el grupo MB, donde la positividad en los casos baciloscopia positivos decreció desde el 100% al 56,2% con rRNA 16S y al 42,8% con rDNA 16S y PCR respectivamente, después de los 9-12 meses de tratamiento, siendo a los 2 años todos negativos, menos un caso que permaneció positivo con PCR. Los casos MB con baciloscopia negativa siguieron la misma tendencia, 100% de positividad detectado por rRNA 16S y PCR, 75% detectado por rDNA 16S y decreció hasta la negatividad a los 9-12 meses de tratamiento. Estos resultados apuntan hacia un posible potencial de estas técnicas como apoyo molecular para el diagnóstico de casos MB baciloscopia negativos y el control de la respuesta al tratamiento. Sin embargo, la prueba definitiva exige ser valorada mediante estudios prospectivos de seguimiento

Nucleic acid sequences of Mycobacterium leprae were detected using gene probes hybridizing with targeting ribosomal RNA (16S rRNA), ribosomal DNA (16s rDNA) and gene amplification techniques (PCR) in skin lesion of paediatric leprosy patients and the effect of treatment on the by these methods. Eighty paediatric leprosy patients were included in the study. Most cases (79%) were between 9 and 16 years of age. Cases were divided into three groups according to treatment status, viz- untreated (30=, undergoing treatment (30), and at the end to treatment (20). Clinical and slit smear examination for acid fast bacilli (AFB) was performed and nucleic acids were extracted and fractionated form skin biopsies. M. leprae specific 16S rRNA and 16S rDNA was detected by hybridization with gene probes whereas the 36kKa gene sequence was detected by a gene amplification assay (PCR). The cases were classified as paucibacillary (PB) and multibacillary (MB) by the standard criteria of WHO (1988). Positivity of 16S rRNA in PB cases decreased from 60% in untreated to 10.5% after 4-8 months of treatment whereas for 16S rDNA, it decreased from 50% to 21% for PCR form 70% to 36.8% for the same specimen, and all became negative at 1 year. Similar trends were seen in MB cases where positivity in smear positive untreated cases decreased from 100% to 56.2% with 16S rRNA and 42.8% with 16S rDNA and PCR, respectively, after 9-12 months of treatment and all became negative at 2 years except one case which remained positive with PCR. Similar results were observed in smear negative MB cases, 100% positivity detected by 16S r RNA and PCR, 75% detected by 16S rDNA decreased to zero after 9-12 months of therapy. This study suggests the potential usefulness of gene probes targeting 16S rRNA and 16S rDNA and PCR as supportive molecular tools for diagnosis of smear negative evolving MB disease and also monitoring the response to treatment, these observation however, needs to be validated in prospective follow up studies

Ensayo colorimétrico de hibridación en microplacas para la detección de Mycobacterium leprae 16s rRNA en muestras clínicas

Se ha desarrollado un ensayo colorimétrico de hibridación en microplacas para simplificar la detección de Mycobacterium leprae en muestras clínicas. La técnica detecta los productos amplificados por un ensayo muy sensible RT-PCR con diana sobre una secuencia especie-específica del rRNA 16S bacteriano. El test detectó hasta 10 bacilos aislados de los nódulos linfáticos de ratones desnudos infectados o biopsias cutáneas humanas. La sensibilidad para el diagnóstico en nuestras clínicas se evaluó en 58 biopsias cutáneas de 58 pacientes de lepra sin tratar. El ensayo detectó amplificados RT-PCR de M. leprae en el 100 por ciento de las biopsias de pacientes con lepra multibacilar y el 80 por ciento de biopsias de pacientes paucibacilares, con una sensibilidad total de 91.3 por ciento. El test resultó ser muy específico ya que no se detectaron amplificaciones en las biopsias de pacientes normales o afectados de otras enfermedades distintas a la lepra. La variante colorimétrica es más rápido, sensible y simplifica la detección de los amplificados RT-PCR comparado con el análisis por Southern blot. Puede ser útil para el diagnóstico de los casos difíciles de lepra y como el RNA se degrada rápidamente después de la inactivación celular siendo útil para la evaluación de la respuesta al tratamiento y distinción de recidivas de reacción (AU)

Transcriptional regulation of the chicken CYP2H1 gene. Localization of a phenobarbital-responsive enhancer domain.

The mechanism by which the drugs phenobarbital and 2-allyl-2-isopropylacetamide induce levels of chicken cytochrome P-450 (CYP) mRNAs has been investigated in primary hepatocyte cultures from 17-day-old chick embryos. It has been demonstrated that three CYP mRNAs of 3.5, 2.5, and 2.2 kilobases (kb) are strongly induced by phenobarbital in primary hepatocytes, as found previously in chick embryo liver in ovo (Hansen, A. J., Elferink, L. A., and May, B. K. (1989) DNA (NY) 8, 179-191), and that, at least for the 3.5-kb mRNA, this is predominantly a result of enhanced transcription of the corresponding gene, CYP2H1. Transient transfection assays were carried out in primary cultures using constructs containing different lengths of CYP2H1 gene 5'-flanking sequence fused to the reporter chloramphenicol acetyl-transferase (CAT) gene. These experiments established that cis-acting elements located in the first 0.5 kb of the CYP2H1 gene 5'-flanking region direct high basal expression of the CAT gene, but do not mediate phenobarbital inducibility. When constructs containing more than 1.1 kb of CYP2H1 gene 5'-flanking sequence were examined, phenobarbital induction of CAT expression was observed, and a drug-responsive domain between positions -5.9 and -1.1 kb was identified. This domain has the properties of an enhancer, since it is able to confer phenobarbital responsiveness to the enhancerless SV40 promoter when tested in either orientation or at different distances from the promoter. The enhancer domain also responds to 2-allyl-2-isopropylacetamide, but whether the action of the two drugs is mediated by a single nuclear receptor interacting with common DNA elements in the domain remains to be established.